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聚焦：細胞免疫熒光實驗步驟
發(fā)布時間： 2021-03-23 點擊次數(shù)： 2060次細胞株 免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后，采用熒光標(biāo)記，標(biāo)記完成后，顯微鏡下觀察細胞內(nèi)某種抗原成分的多少，從而做出一個定位研究，也可以為細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)提供一個明確的指導(dǎo)，細胞免疫熒光具有敏感性強、特異性高、速度快的特點，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù)，也是比較準(zhǔn)確的。
一、實驗方法原理在進行細胞免疫熒光過程中，需要用到細胞爬片，通過將爬片浸在細胞培養(yǎng)基內(nèi)，細胞在爬片上生長，進而進行細胞的免疫熒光。
二、實驗材料1.細胞樣品2.試劑、試劑盒：多聚甲醛 70%甲醇 丙酮 PBS Triton BSA DAPI染液 DABCO Tris 甘油3.儀器、耗材：玻片
三、細胞爬片免疫熒光實驗步驟第yi天：1. 在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室溫通透20min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）；4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；
第二天：6. 加熒光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。7. 復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5min，對標(biāo)本進行染核，PBST 5minx4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
注意事項1.取細胞株爬片時，動作應(yīng)輕柔，防止將細胞爬片夾碎，影響實驗進程。2.種細胞過程中，要注意將細胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細胞局部生長過密。
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