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    ELISA試劑盒的用途

    發(fā)布時間: 2014-07-04  點擊次數(shù): 995次

     1.抗原  
    在ELISA中應用的抗原要求有較高的特異性、親和力和純度。主要有3類,即自然抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。自然抗原的純度不高,特異性不強;合成抗原一般為多肽片段,缺乏天然抗原所具有的立體結構表位,親和力不高,可能導致相應表位的抗體漏檢;基因重組抗原具有安全、特異性強、親和力高、產(chǎn)量大等特點,是一種比較理想的抗原,但其純化比較困難。 

     
        2.抗體  
    在ELISA中應用的抗體可分為多克隆抗體(多抗)和單克隆抗體(單抗)。多抗取白免疫動物的抗血清,制備較簡單,但抗血清成分復雜,除含針對抗原(多個表位)的抗體外,還含有多種其他抗體,親和力和特異性相對要低于單抗,且制備周期長,批間差異較大。而單抗僅針對抗體的單一表位,親和力和特異性均較多抗高,且制備技術成熟,產(chǎn)量大,批間差異小,但結合位點的單一也正是其弱點之所在,在雙抗體夾心法中,如包被和指示抗體使用同一單抗,則由于結合位點的缺乏,容易造成假陰.性結果。在使用雙單抗一步法時,應注意抗原過剩時的“鉤狀效應”
     
        3.酶和底物  
       在ELISA中zui常用的酶為HRP和ALP。
        (1)HRP:是一種糖蛋白,含糖量約18%,分子量為44kD,在蔬菜作物辣根中含量很高。HRP是一種復合酶,由主酶(酶蛋白)和輔基(亞鐵血紅素) 結合形成一種卟啉蛋白質。主酶為五色糖蛋白,在275nm波長處有zui高吸收峰;輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán),是酶的活性基團,在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP的純度用純度值(reinhartzahl,RZ)表示,RZ=A403nm/A275nm,即403nm的吸光度與280nm的吸光度之比,高純度HRP的RZ值應≥3.0。HRP質量的另一重要指標是酶活力,以單位(unit,U)表示。用于標記的HRP比活性應≥250U/mg。HRP的作用底物為H202,催化下列反應;
    DH2+H202  HRP  D+2H2O
       上式中DH2為供氫體(即底物),H2O2為受氫體。HRP對受氫體的專一性很高,除H2O2外,僅作用于小分子醇和尿素的過氧化物。HRP的底物有多種,在ELISA中常用的有:鄰苯二胺(orthophenylenediamine,OPD),四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5- tetramethyl-benzidine,TMB)和2,2,-連氮基-雙-3-乙基苯噻唑啉磺酸鹽[2,2,-azino-bisc(3- ethyl-benzthiazolinesulfonate-6),ABTS]。三者各有優(yōu)缺點:OPD是在ELISA中應用zui多的底物,靈敏度高,比色方便,但配成溶液后穩(wěn)定性差,且有致異變性;TMB經(jīng)酶作用后由五色變藍色,加酸終止反應后顯,目測對比鮮明,可比色定量,溶液的穩(wěn)定性也較差,但無致異變性,因此應用日見增多;ABTS雖然靈敏度不如OPD和TMB,但空白值很低。
        (2)ALP:是一種磷酸酯的水解酶,用做示蹤酶的ALP活性應在l 000U/mg以上。ALP常用的底物為對硝基苯磷酸鹽(PNP),降解產(chǎn)物為的對硝基酚。經(jīng)NaOH終止酶反應后,顏色維持比較穩(wěn)定。
    在ELISA中酶作用于底物后生成有色物質、熒光物質或導致化學發(fā)光,分別可用分光光度計、熒光光度計測量及照度計測量。熒光和化學發(fā)光測定的敏感度均高于比色測定,標準曲線的線性范圍亦較比色反應寬,測定效果優(yōu)于常用的比色ELISA。
     
        4.固相載體  
    固相載體是ELISA中用以分離結合標記物和游離標記物的主要手段,應與各種免疫活性物質有良好的結合性能并且不改變其免疫活性。常用的固相載體有聚苯乙烯塑料和硝酸纖維素膜。
     
        5.包被  
    將免疫活性物質(抗原或抗體)結合于固相載體上的過程稱為包被。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纖維薄膜等;常用的方法有吸附法、化學交聯(lián)法及親和素-生物素間接包被法,特別是后一方法,效率高,而且可用以包被不易吸附在固相上的各種免疫活性物質。具體做法是先將鏈霉親和素包被在固相載體上,然后使與生物素化的抗原或抗體與之結合。由于親和素與生物素之間的高親和力,抗原或抗體即間接結合在親和素包被的固相上。

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